Biología Celular del RNA

Graciela L. Boccaccio - Fundación Instituto Leloir

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Cuando las células se encuentran en condiciones poco favorables o adversas despliegan una respuesta protectiva para ayudar a la supervivencia y evitar la muerte celular.  Esta reacción se da en todos los organismos y es denominada “respuesta al estrés celular”. El estrés celular es importante en diversas patologías humanas, y la intervención del balance muerte-sobrevida es la base racional de numerosas terapias. Empleando modelos in vitro de estrés celular que recapitulan lo que ocurre en condiciones patológicas, estudiamos cómo la célula detiene la generación de las proteínas que normalmente sintetiza para estimular la producción de proteínas protectivas. Este mecanismo celular de defensa involucra cambios dramáticos en un tipo especial de organelas celulares, las cuales están siendo descriptas en nuestro laboratorio y que colectivamente denominamos cuerpos de silenciamiento de ARN mensajeros (ARNm). Los ARNm son los intermediarios entre el genoma y la maquinaria de síntesis proteica y los cuerpos de silenciamiento de ARNm son grandes agregados macromoleculares en donde se almacenan ARNm silenciados, es decir que no están siendo empleados para la producción de nuevas moléculas de proteína. paar pagina web Los cuerpos de silenciamiento de ARNm no son exclusivos de la respuesta de estrés celular. Recientemente encontramos que las neuronas almacenan ARN mensajeros en cuerpos de silenciamiento en las cercanías de la sinapsis, que es el sitio en el que se produce la comunicación entre dos neuronas. Estos cuerpos de silenciamiento sinápticos controlan la producción local de proteínas a demanda de la actividad neuronal, permitiendo el aprendizaje y la memoria.   http://www.leloir.org.ar/blog/realizan-workshop-biologia-celular-y-molecular-del-arn-en-el-instituto-leloir/  

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Nos interesa entender cómo funcionan las nuevas organelas celulares denominadas cuerpos de silenciamiento de ARN mensajero (ARNm) que identificamos recientemente. Existen distintos tipos de cuerpos de silenciamiento de ARNm. Los “Gránulos de Estrés” (SGs) se ensamblan transitoriamente durante la respuesta de estrés celular y almacenan moléculas de ARNm que se encuentran transitoriamente inactivas durante la reacción de estrés celular. Los “Cuerpos de Procesamiento” (PBs) son reservorios universales de ARNm y responden a distintos estímulos fisiológicos. Finalmente, los cuerpos de silenciamiento sináptico (SyAS foci) están ubicados en las cercanías de la post-sinapsis y responden a distintos neurotransmisores. Empleamos una combinación de estrategias de bioquímica, biología celular y molecular, y el uso intensivo de microscopía avanzada, incluyendo microscopía confocal en tiempo real para contestar las siguientes preguntas:
  1. Cuál es la relevancia funcional de los gránulos de estrés y como se regula su formación?
Encontramos que la formación de SGs está conservada en vertebrados e invertebrados, por lo que frecuentemente recurrimos a células de mamíferos y de insectos (en particular del organismo modelo Drosophila) en cultivo. En estos sistemas experimentales es posible manipular selectivamente la expresión de distintos genes para indagar su función aplicando la estrategia de ARN de interferencia (ARNi). Esta consiste en anular la expresión de un gen dado presentándoselo a la célula como si fuera un gen foráneo de origen viral. En colaboración con el Drosophila RNAi Screen Center (DRSC), Harvard, Realizamos “screens por ARNi” en Drosophila, en el cual “apagamos” uno por uno los distintos genes, para identificar cuales están involucrados en la formación de los SGs y PBs. Encontramos que el citoesqueleto, motores moleculares y proteínas que estabilizan el aparato biosintético de proteínas gobiernan coordinadamente la dinámica de SGs y PBs (Thomas y col, 2009; Loschi y col 2009; Thomas et al., 2011). Mas recientemente, encontramos un número de genes vinculados a enfermedades neurodegenerativas y cuyos mecanismos de acción estamos indagando (Perez Pepe y col 2012).  
  1. Cómo funcionan los cuerpos de silenciamiento de ARN sinápticos para controlar la producción local de proteínas?
   proj The translational repressor mSmaug1/Samd4a form RNA silencing bodies at the post-synapse, that we termed S-foci. The S-foci rapidly respond to the stimulation of NMDAR and release CamKII-alpha mRNA and likely several other unknown transcripts. As expected for a molecule involved in synaptic translation, the KD of Smaug1 seriously affects synapse morphology and function in hippocampal neurons (Baez et al., 2011; Pascual et al., 2012). In addition, we found that the exoribonuclease XRN1 form a distinct type of bodies located at the post-synapse, that are distinct from S-foci and PBs, and that we termed Synaptic Xrn1 (SX)-bodies (Luchelli et al., 2015). The SX-bodies respond to synaptic stimulation with a distinct pattern, and they slowly grow upon NMDAR activation whereas the S-foci dissolve. Supporting a role for the SX-bodies in translational regulation, we found that XRN1 KD affects the global translational silencing triggered by NMDAR activation. In addition to this response to NMDA, SX-body dynamics is affected by the stimulation of metabotropic receptors. We found that both S-foci and SX-bodies dissolve with different time courses upon mGluR activation. In turn, RNA granules containing Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) display yet another response pattern. We found that FMRP granules do not respond to NMDA and rapidly dissolve upon mGluR stimulation. The regulated assembly of S-foci, SX-bodies and FMRP granules directly controls which mRNA species are available to enter translation, thus providing a mechanism for the control of the local transcriptome upon specific synapse stimuli (Thomas et al., 2014; Pimentel and Boccaccio, 2014). Nuestros estudios en neuronas condujeron al descubrimiento de distintos tipos de cuerpos de silenciamiento sináptico, a los que colectivamente denominamos SyAS foci (Baez et al., 2005, Baez et al. J Cell Biol, 2011; Luchelli et al. 2015). Encontramos que cada tipo de cuerpo de RNA responde con un patrón único, ensamblándose o desensamblándose muy rápidamente frente a distintos estímulos sinápticos, y liberando ARNm para la producción de proteínas específicas. La exquisita dinámica de los SyAS foci permite cambios locales del proteoma (conjunto de proteínas) en cada sinapsis en forma independiente de otras sinapsis de la misma neurona, las cuales pueden estar recibiendo al mismo tiempo otros estímulos. De esta manera, se controla la fuerza de la sinapsis, es decir el reforzamiento o el debilitamiento de las conexiones entre neuronas, las cuales son la base de la memoria (Pascual et al., 2012; Thomas et al. 2014; Pimentel y Boccaccio, 2014; Thomas et al., 2016, Fernandez Alvarez et al., 2016). Colaboraciones   -Hernan Greco, Deptm Física-FCEyN, UBA, Argentina   -Elisa Izaurralde, Max Planck Institute, Tübingen, Alemania, Ribonucleopartículas sinápticas.   -Stephanie Mohr, DRSC, Harvard, USA., Reguladores de la dinámica de gránulos de estrés.   -Ezequiel Surace, FLENI BsAs, Argentina, Gránulos de estrés y agregados proteicos en enfermedades neurodegenerativas.

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Graciela L. Boccaccio
Jefe de Laboratorio - gboccaccio@leloir.org.ar



Karol Arizaca Maquera
Estudiante de Master



Natalia Contreras
Becario Doctoral CONICET



Ana Julia Fernández Álvarez
Investigador Asociado



Leticia Larotonda
Tesinista Licenciatura UNQ



Pablo La Spina
Becario Doctoral CONICET



Carolina Lizarazo
Estudiante de Master



David Mancilla
Colaborador externo



Marcelo Pérez-Pepe
Becario Postdoctoral CONICET



Jerónimo Pimentel
Becario Doctoral CONICET



María Gabriela Thomas
Investigador Asociado