Ciclo Celular y Estabilidad Genómica

Vanesa Gottifredi - Fundación Instituto Leloir

idioma:

En la actualidad la primera línea de defensa contra el cáncer es indefectiblemente la quimioterapia (combinada o no con una intervención quirúrgica). La gran mayoría de los agentes utilizados basan su citotoxicidad en la generación directa o indirecta de problemas en la replicación de ADN que afectan en mayor grado a células transformadas que poseen una alta tasa de replicación. Por esto, el estudio de los mecanismos involucrados en el copiado de ADN dañado (mecanismos de tolerancia, chequeo, etc) es fundamental para facilitar la identificación de factores claves en la sobrevida tumoral y la quimioresistencia. Identificamos al regulador de quinasas dependientes de ciclinas p21 como el primer regulador negativo global de un proceso de tolerancia llamado síntesis por translesión. P21 es un potente inhibidor del reclutamiento de polimerasas de la familia Y a ADN lesionado. P21 controla también la progresión de horquillas de replicación en el ADN lesionado y su regulación negativa es necesaria para mantener la estabilidad genómica después de irradiación UV. Proponemos que p21 es un regulador central de procesos mutagénicos asociados a la replicación y que por lo tanto es una proteína con funciones multiples en distintas etapas del ciclo celular. Además encontramos que una proteína involucradas en el censado de ADN lesionado (Chk1) regula coordinadamente el ciclo celular y los eventos de tolerancia al ADN. La información aportada por nuestros estudios podría ser muy útil para el diseño/reformulación de terapias combinadas, secuenciales y adaptadas a cada paciente.

Antecedentes

Las lesiones al ADN son eventos frecuentes que pueden ser provocados por agentes externos y también el propio metabolismo celular. Los cambios topológicos generados por dichas lesiones pueden bloquear la duplicación del ADN en manera irreversible y provocar muerte celular. Por esto, mecanismos moleculares denominados procesos de tolerancia a ADN dañado evitan la muerte promoviendo la replicación de ADN lesionado. Lamentablemente dichos mecanismos pueden, en un contexto patológico, ser mutagénicos y promover la quimioresistencia. Por ello, la identificación de reguladores de mecanismos de tolerancia puede ser de extrema utilidad en la lucha contra el cáncer.

Objetivos

Nuestros interrogantes generales son los siguientes
  • Como se coordinan espacial y temporalmente los procesos de replicación de ADN y de tolerancia al ADN lesionado?
  • Como se restringe, espacial y temporalmente, el reclutamiento de factores de tolerancia a horquillas de replicación que encuentran ADN lesionado?
  • Se puede regular negativamente los procesos de tolerancia para reducir la viabilidad tumoral?

Metodología

Las aproximaciones experimentales se agrupan en 3 categorías básicas:
  • El análisis de niveles e interacciones proteicas: se destaca la medición de vida media de proteínas, la identificación y cuantificación de niveles ubiquitinación no degradativa y degradativa de proteínas, la medición de interacciones entre proteínas asociadas a cromatina, la utilización de siRNA para regular negativamente blancos específicos.
  • Los estudios de localización subnuclear y los análisis de movilidad proteica en células vivas: monitoreamos cambios en la localización subnuclear de distintas proteínas y utilizamos criterios de cuantificación adaptados a cada factor específico analizado. Aplicamos técnicas de irradiación UV global y local a través de filtros de polincarbonato y de irradiación con partículas alfa. Se realizan estudios en células vivas monitoreando la movilidad de proteínas fusionadas a etiquetas fluoresencentes. Estos últimos incluyen el análisis espacial y la irradiación local utilizando microscopía de dos fotones.
  • Los estudios de consecuencias biológicas asociadas a alteraciones de las vías estudiada: somos expertos en el manejo de citometría de flujo asociada a ciclo celular. Además, para lograr una detección directa de TLS, aplicamos una técnica, llamada DNA combing o ensayo de fibras, que permite cuantificar la velocidad de progresión de horquillas de replicación individuales. También aplicamos un ensayo funcional de evaluación de frecuencia de mutaciones que puede resultar de alteraciones en el proceso de tolerancia.

Speroni J, Federico MB, Mansilla S, Soria G and Gottifredi V. (2012). A kinase independent role of Chk1 in the replication of damaged DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. May 8, 109(19) 7344-9. PubMed

Soria, G., Gottifredi. V. PCNA-coupled p21 degradation after DNA damage: and exception that confirms the rule?DNA repair. 9: 358-364 (2010).     PubMed

Soria, G., Belluscio, L., van Cappellen, W.A., Kanaar, R., Essers, J., Gottifredi, V. DNA damage induced Pol eta recruitment takes place independently of the cell cycle phase. Cell Cycle. 8: 3340-3348 (2009).     PubMed

Prives, C., Gottifredi, V. The p21 and PCNA partnership: a new twist for an old plot. Cell Cycle. 7: 3840-3846 (2008).     PubMed

Soria, G., Speroni, J., Podhajcer, O.L., Prives, C., Gottifredi, V. p21 differentially regulates DNA replication and DNA-repair-associated processes after UV irradiation. J Cell Sci. 121: 3271-3282 (2008).     PubMed

Soria, G., Podhajcer, O., Prives, C., Gottifredi, V. P21Cip1/WAF1 downregulation is required for efficient PCNA ubiquitination after UV irradiation. Oncogene. 25: 2829-2838 (2006).     PubMed

Gottifredi, V., Prives, C. The S phase checkpoint: when the crowd meets at the fork. Semin Cell Dev Biol. 16: 355-368 (2005).     PubMed

Gottifredi, V., McKinney, K., Poyurovsky, M. V., and Prives, C. (2004). Decreased p21 levels are required for efficient restart of DNA synthesis after S phase block. J Biol Chem 279, 5802-5810. PubMed

Gottifredi, V., and Prives, C. (2001). Molecular biology. Getting p53 out of the nucleus. Science 292, 1851-1852. IF: 23,32 PubMed

Gottifredi, V., Shieh, S., Taya, Y., and Prives, C. (2001). p53 accumulates but is functionally impaired when DNA synthesis is blocked. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 1036-1041. PubMed

Gottifredi, V., Karni-Schmidt, O., Shieh, S. S., and Prives, C. (2001). p53 down-regulates CHK1 through p21 and the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol 21, 1066-1076. PubMed





Vanesa Gottifredi
Jefe de Laboratorio - vgottifredi@leloir.org.ar



María Belén Federico
Becario Doctoral CONICET



Martín Habif
Becario Doctoral CONICET



Sabrina Mansilla
Becario Doctoral CONICET



Mario Alejandro Riera
Becario Doctoral CONICET



Juliana Speroni
Becario Posdoctoral ANPCyT



María Belén Vallerga
Becario Doctoral ANPCyT