Ciclo Celular y Estabilidad Genómica

Vanesa Gottifredi - Fundación Instituto Leloir

idioma:

Las células cancerosas se duplican constantemente. Por lo tanto, la replicación del ADN tiene lugar con mucha más frecuencia que en las células normales. El éxito del proceso de duplicación de ADN depende en gran medida de la calidad del ADN molde. Por esto se ha propuesto que el deterioro en la calidad de dichos moldes debería promover una duplicación incompleta del ADN y por lo tanto promover la muerte de células tumorales. Se implementaron entonces protocolos basados en la utilización de productos químicos y radiación, con el fin de evitar la duplicación completa del ADN y perjudicando la supervivencia de las células hijas. Tal principio es la esencia de la quimioterapia. Desafortunadamente, todos sabemos que la quimioterapia no es tan exitosa como esperábamos. Esto se debe a que  no solo la quimio y radio terapia arruinan la calidad de nuestro ADN. La calidad del ADN molde de nuestras células normales no es nunca óptima. Nuestro ADN es constante y diariamente dañado por fuentes de estrés endógenas (por ejemplo, estrés oxidativo) y exógenas (por ejemplo, radiación UV). Por lo tanto, en nuestras células sanas, todo molde de ADN está dañado. Y millones de años de evolución han impulsado el desarrollo de una red molecular que ayuda a utilizar moldes dañados como plantillas de copiado. Dicha red molecular garantiza la reparación eficiente y promueve, en caso de ser necesario, el uso del ADN dañado como plantilla replicativa. Desafortunadamente, mientras que dicha red de señales moleculares promueve la sobrevida de células sanas (y por lo tanto mantiene la homeostasis de organismos multicelulares) y aprovechado por células cancerosas para escapar de tratamientos quimio- y radio-terapéuticos. Mi laboratorio intenta identificar factores centrales en esta red. Evaluamos la contribución de una proteína dada a la prevención de la muerte celular y la inestabilidad genómica después del estrés genotóxico. Alternativamente, buscamos agentes que sensibilizan específicamente las células cancerosas a la muerte celular para luego explorar el mecanismo que promueve dicho efecto terapéutico. Esperamos que nuestra investigación pueda servir para proponer cambios que mejoren los protocolos de quimioterapia actuales al ser combinados con la eliminación quirúrgica de moléculas clave que facilitan la utilización de ADN dañando como molde replicativo.  

Antecedentes

Las lesiones al ADN son eventos frecuentes que pueden ser provocados por agentes externos y también el propio metabolismo celular. Los cambios topológicos generados por dichas lesiones pueden bloquear la duplicación del ADN en manera irreversible y provocar muerte celular. Por esto, mecanismos moleculares denominados procesos de tolerancia a ADN dañado evitan la muerte promoviendo la replicación de ADN lesionado. Lamentablemente dichos mecanismos pueden, en un contexto patológico, ser mutagénicos y promover la quimioresistencia. Por ello, la identificación de reguladores de mecanismos de tolerancia puede ser de extrema utilidad en la lucha contra el cáncer.

Objetivos

Nuestros interrogantes generales son los siguientes
  • Como se coordinan espacial y temporalmente los procesos de replicación de ADN y de tolerancia al ADN lesionado?
  • Como se restringe, espacial y temporalmente, el reclutamiento de factores de tolerancia a horquillas de replicación que encuentran ADN lesionado?
  • Se puede regular negativamente los procesos de tolerancia para reducir la viabilidad tumoral?

Metodología

Las aproximaciones experimentales se agrupan en 3 categorías básicas:
  • El análisis de niveles e interacciones proteicas: se destaca la medición de vida media de proteínas, la identificación y cuantificación de niveles ubiquitinación no degradativa y degradativa de proteínas, la medición de interacciones entre proteínas asociadas a cromatina, la utilización de siRNA para regular negativamente blancos específicos.
  • Los estudios de localización subnuclear y los análisis de movilidad proteica en células vivas: monitoreamos cambios en la localización subnuclear de distintas proteínas y utilizamos criterios de cuantificación adaptados a cada factor específico analizado. Aplicamos técnicas de irradiación UV global y local a través de filtros de polincarbonato y de irradiación con partículas alfa. Se realizan estudios en células vivas monitoreando la movilidad de proteínas fusionadas a etiquetas fluoresencentes. Estos últimos incluyen el análisis espacial y la irradiación local utilizando microscopía de dos fotones.
  • Los estudios de consecuencias biológicas asociadas a alteraciones de las vías estudiada: somos expertos en el manejo de citometría de flujo asociada a ciclo celular. Además, para lograr una detección directa de TLS, aplicamos una técnica, llamada DNA combing o ensayo de fibras, que permite cuantificar la velocidad de progresión de horquillas de replicación individuales. También aplicamos un ensayo funcional de evaluación de frecuencia de mutaciones que puede resultar de alteraciones en el proceso de tolerancia.

Gottifredi V, Wiesmüller L. The Tip of an Iceberg: Replication-Associated Functions of the Tumor Suppressor p53. Cancers (Basel). 2018 Jul 28;10(8). pii: E250. doi: 10.3390/cancers10080250

Federico MB, Campodónico P, Paviolo NS, Gottifredi V. Beyond interstrand crosslinks repair: contribution of FANCD2 and other Fanconi Anemia proteins to the replication of DNA. Mutat Res. 2018. Mar; 808:83-92. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2017.09.004. Epub 2017 Sep 14.

Lerner LK, Francisco G, Soltys DT, Rocha CR, Quinet A, Vessoni AT, Castro LP, David TI, Bustos SO, Strauss BE, Gottifredi V, Stary A, Sarasin A, Chammas R, Menck CF. Predominant role of DNA polymerase eta and p53-dependent translesion synthesis in the survival of ultraviolet-irradiated human cells. Nucleic Acids Res. 2017 Feb 17;45(3):1270-1280. doi: 10.1093/nar/gkw1196

Guttlein l, Benedetti L, Fresno C, Mansilla F, Rotondaro C, Raffo X, Salvatierra E, Bravo A, E Fernandez, Gottifredi V, Zwiner N, Llera A, Podhajcer O. SPARC promotes murine breast primary tumor growth and lung metastasis implantation through molecular mechanisms useful to predict human cancer outcome. Molecular Cancer Research. Mol Cancer Res. 2016 Dec 28. pii: molcanres.0243.2016. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-16-0243-T

Mansilla SF, Bertolin AP, Bergoglio V, Pillaire MJ, González Besteiro MA, Luzzani C, Miriuka SG, Cazaux C, Hoffmann JS, Gottifredi V. Cyclin Kinase-independent role of p21CDKN1A in the promotion of nascent DNA elongation in unstressed cells. Elife. 2016 Oct 14;5. pii: e18020. doi: 10.7554/eLife.18020

Hampp S, Kiessling T, Buechle K, Mansilla SF, Thomale J, Rall M, Ahn J,  Pospiech H, Gottifredi V, and Wiesmüller L. DNA damage tolerance pathway involving DNA polymerase ι and the tumor suppressor p53 regulates DNA replication fork progression. Proc Natl Acad Sci USA. 2016 Jul 26;113(30):E4311-9. doi: 10.1073/pnas.1605828113.

MB Federico, MB Vallerga, A Rald, NP Paviolo, JL Bocco, M Di Giorgio, G Soria, Gottifredi V. Integrity after UV Irradiation requires FANCD2-mediated Repair of Double Strand Breaks'.  PLoS Genetics 12 (1), e1005792-e1005792. doi: 10.1371/journal.pgen.1005792.

Vallerga MB, Mansilla SF, Federico MB, Bertolin AP, Gottifredi V. Rad51 prevents Mre11-dependent degradation and excessive primpol-mediated elongation of nascent DNA after UV irradiation.  Proc Natl Acad Sci USA. 112 (48), E6624-E6633. doi: 10.1073/pnas.1508543112. Epub 2015 Nov 16

Bertolin AP, Mansilla SF and Gottifredi V. The identification of translesion DNA synthesis regulators: inhibitors in the spotlight. DNA Repair(Amst). 2015 Aug;32:158-64. doi: 10.1016/j.dnarep.2015.04.027. Epub 2015 May 12.

MA Gonzalez Besteiro, Gottifredi V. The fork and the kinase: A DNA replication tale from a CHK1 perspective. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. Mutat Res. 2015 Jan-Mar;763:168-80. doi: 10.1016/j.mrrev.2014.10.003. Epub 2014 Oct 22.

Quinet A, Vessoni AT; Rocha CC; Gottifredi V, P; Biard D; Sarasin, A; Menck CF and A Stary. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA REPAIR. 2014; 14, 27-38.( epublished ehead of print dic 2013). doi: 10.1016/j.dnarep.2013.12.005. Epub 2013 Dec 28.

Mansilla SF, Soria G, Vallerga MB, Habif M, Martínez-López W, Prives C, Gottifredi V. UV-triggered p21 degradation facilitates damaged-DNA replication and preserves genomic stability. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (14), 6942-6951. doi: 10.1093/nar/gkt475. Epub 2013 May 30. IF: 9,1.

Costantino VV, Mansilla SF, Speroni J, Amaya C, Cuello-Carrión D, Ciocca DR, Priestap HA, Barbieri MA, Gottifredi V*, Lopez LA*. The sesquiterpene lactone dehydroleucodine triggers senescence and apoptosis in association with accumulation of DNA damage markers. PLoS One. 2013; 8(1):e53168. doi: 10.1371/journal.pone.0053168.* corresponding authors.





Vanesa Gottifredi
Jefe de Laboratorio - vgottifredi@leloir.org.ar
Scientific Report



Sabrina Mansilla
Investigadora Asistente - CONICET
Scientific Report



Marina Alejandra González Besteiro
Investigadora Asistente - CONICET
Scientific Report



Julieta Martino
Becaria Posdoctoral - ANPCyT
Scientific Report



Natalia Soledad Paviolo
Becaria Posdoctoral - CONICET
Scientific Report



Nicolás Calzetta
Becario Doctoral - CONICET
Scientific Report



María Belén de la Vega Paéz
Becaria Doctoral - CONICET
Scientific Report



Sofia Venerus Arbilla
Becaria Doctoral - ANPCyT
Scientific Report



Sofía Loureiro
Tesinista de Licenciatura - Pasante
Scientific Report



Victoria Pauwels
Tesinista de Licenciatura - Pasante
Scientific Report